Generalidades.
Características microbiológicas:
Principales características.
Fisiología.
Principios de detección, recuento e identificación.
Toxinogénesis.
Efecto biológico de las neurotoxinas botulínicas.
Sintomatología.
Epidemiología.
Prevención.
 
 
 
 
 

 EL Clostridium Botulinum, junto con otros Clostridium, excepcionalmente son capaces de generar o producir neurotoxinas de acción paralizante.
El Clostridium Botulinum puede causar una enfermedad llamada Botulismo, que puede ser adquirida de las siguientes maneras:
Ingestión de una toxina preformada en un alimento donde se ha desarrollado la bacteria. Se trata de una intoxicación Sensu stricto, denominada a veces intoxicación.

Por la ingestión de la toxina preformada con el alimento, y bacterias y esporas, presentes también en el alimento, que franquean la barrera gástrica, y se implantan en el intestino, donde producen la toxina; se trata entonces de una toxiinfección.

Por la ingestión de bacterias/esporas que, por medio de un proceso similar al anterior, se multiplican y producen la toxina ?in situ?, provocando una toxiinfección botulínica. Si el mecanismo citado en primer lugar es el que se conoce desde hace más tiempo, el más clásico, es evidente, que en la actualidad, los procesos toxiinfecciosos, son bastante frecuentes en el hombre. El tercer mecanismo, en principio estrictamente infeccioso, se ha demostrado recientemente que se produce de forma indiscutible, aunque todavía no se conoce su frecuencia.
 
 
 
 
 

Principales caracteres del Clostridium Botulinum

Grupo Tipo toxinógeno Proteasa Lipasa Hidrólisis de Glucosa Fructosa
 de las cepas   la esculina
I A,B,F + - - + -
II B,E,E - - - + +
III C,D - + - + V
IV G + - - - -
 

Grupo Ribosa Productos del Azúcares de ADN ADN ADN
 Sacarosa metabolismo la pared Tipo A Tipo C Tipo E
I - ABVib Glucosa 50 a 100 20 10
II + A, B1 Glucosa y 10 10 100
   Galactosa
III - APB Ausencia de 10 38 a 100 10
   azúcar o trazas
   de glucosa
IV - Abibiv NTc NT NT NT
  pha

+: Fermentado (pH ? 5,5); f1 debilmente fermentado (pH 5,6 a 5,8); -: no fermentado; V: variable 50% de las cepas +, 50% de las cepas -.
a: ácido acético, p: ácido propiónico, b: ácido butírico, ib: ácido isobutírico,
      iv: ácido isovaleriánico, l: ácido káctico, pha: ácido fenilacético.
       Los productos principales se indican en mayúscula, los menos importantes
                  En minúscula.
NT: no determinado.
 
 

 Datos de temperatura para Clostridium Botulinum

 Temperatura Optima   Temperatura Mínima
 Tipo E  Otros Tipos Tipo E  Otros Tipos
Crecimiento 30ºC  34 a 37ºC 5ºC  15 a 29ºC
Toxinogénesis 28 a 30ºC  34ºC 5ºC  15ºC
Esporulación  15 a 41ºC
Activación no necesita  80ºC
Germinación  37ºC   10ºC
Emergencia  31 a 37ºC   10ºC
 
 

Identificación de una toxina a partir de un alimento

10 gr de alimento homogeneizado.
+ diluyente (Na2PHO4 0,2%, gelatina 0,1%, pH 6.8, volumen final máximo = 20-30ml.)
10 minutos a 22ºC.
Tratamiento con tripsina (0,1%, 1 hr a 37ºC) en casos de sospecha de toxina E.
Centrifugar 15 minutos a 6000 r/ min.

Sedimento  de la centrífugación:
Investigación de la toxina después de un cultivo de aislamiento de                   C. Botulinum.
Sobrenadante de la centrifugación (filtardo o adicionado de 1000 UI de penicilina/ml .
Determinación del título tóxico.
( diluciones de 10 en 10).
( ratón vía IP, 1 ml por dilución; 2 ratones por dilución).
Identificación del tipo tóxico
Repartir 6 x 2 ml.
+ suero antibutolínico (0,1 ml)

Suero        A       B      C       D     E     Testigo

Tubo nº     1        2       3       4      5         6

Principales características
El Clostridium Botulinum no está taxonómicamente bien definido como especie, por lo que es considerado como un conjunto de especies. Dentro de los Clostridium Botulinum, podemos encontrar 4 grupos.

Basado en sus caracteres bioquímicos, como la capacidad proteolítica, lipolítica y glucidolítica).
Basado en los catabolitos que produce.
Basado en su fisiología: sensibilidad al oxígeno, bacteriófagos.
Basado en la composición en azúcares de sus paredes celulares y a su ADN: hibridaciones ADN-ADN.

Fisiología

El Clostridium Botulinum se define como un microorganismo Gram + , esporulado, y anaerobio estricto, sus necesidades nutritivas son complejas, y su cultivo se realiza, generalmente en medios también complejos, por ejemplo medio TGY.

Las temperaturas óptima y mínima de crecimiento, toxicogénesis, esporulación y germinación, son muy importantes en microbiología de alimentos, ya que indican la aptitud, de un tipo de Clostridium Botulinum, (E), para germinar desarrollarse y producir toxina a bajas temperaturas, mientras que los otros tipos necesitan de temperaturas bastante más elevadas.

En cuanto al pH, el Clostridium Botulinum se desarrolla cerca de la neutralidad, y por debajo de pH 4,5 se considera imposible su crecimiento, esto se traduce en que los alimentos con pH elevado, como los productos cárnicos, son de mayor riesgo, que alimentos con pH ácido, por ejemplo el ácido cítrico. Existen cepas que se pueden desarrollar a un pH inferior a 4,5, éstas son tratadas con cloruro sódico, y dependiendo de la concentración, inhibe el crecimiento y la germinación de los microorganismos, y a la vez tiene una importante participación en la conservación de alimentos.

Las esporas del Clostridium Botulinum, son termoresistentes, por lo que son resistentes a un tratamiento térmico insuficiente. Pueden esporular tanto en medios de cultivo como en la naturaleza o en los alimentos. La termoresistencia va a depender del medio de producción, de la temperatura de esporulación, y también va a variar con la actividad de agua.

Debido a su gran toxicidad potencial, el Clostridium Botulinum, debe ser imperativamente eliminado de los alimentos que son conservados por esterilización. Los tratamientos térmicos de esterilización de las conservas de alimentos, son calculados, para conseguir una tasa de reducción de las esporas de Clostridium Botulinum de 1012. Siempre que se cumpla con esta norma, el riesgo de contaminación con Clostridium Botulinum es prácticamente nula.

Para determinar el grado de resistencia del microorganismo en cuestión, se debe calcular el valor D, que se define como el tiempo de reducción decimal de una suspensión de esporas a una temperatura dada. El valor D va a variar de acuerdo a  los distintos medios de cultivo, a los medios de esporulación y de germinación. Existe también el valor Z es la pendiente de la curva de los logaritmos de los valores D en función de la temperatura de calentamiento.
Las esporas de Clostridium Botulinum también resisten las radiaciones UV, rayos X, etc, y diversos agentes bactericidas como cloro, hipoclorito, óxido de etileno, alcohol, formaldehído, amonio cuaternario, etc.

Principios de detección, recuento e identificación

El test más rápido para detectar una toxina en un extracto de alimento se denomina toxonotipia botulínica, y se basa en la neutralización in vitro de alícuotas de extracto de diversos sueros específicos de tipo, seguidos de la inyección intraperitoneal de  las mezclas a un animal de experimentación, generalmente ratón, y se observa el mismo durante 48 horas, y se anotan los animales sobrevivientes. En condiciones normales, todos los animales mueren, a excepción de los inyectados con extractos neutralizados con sueros específicos. La cantidad mínima mortal para un ratón es de 10 a 106 DDM. Como el alimento a estudiar, puede contener cantidades variables de toxina por ml de extracto, es conveniente paralelamente titular la actividad letal del extracto.
La investigación de toxina botulínica es a veces bastante difícil de llevar a cabo, por ejemplo en el caso de un alimento sólido muy deshidratado, ya que la toxina puede estar distribuida de forma desigual en el alimento.
En el caso de un alimento sospechoso de ser la causa de un brote de botulismo clínico, se intentará buscar la toxina en dicho alimento si está todavía disponible.
 En el caso de las latas de conservas cerradas, el examen debe hacerse en unas en el momento de la toma de muestra y otras, después de una semana de incubación a 37ºC. El número de las latas que deben tomarse como muestra debe ser razonable, tanto si se trata de controles sistemáticos, como en caso de una intoxicación alimentaria.

Toxinogénesis

Las toxinas se producen durante el crecimiento de las bacterias en medios complejos. Son liberadas rápidamente y por tanto se denominan corrientemente ?exotoxinas?.
Los niveles producidos de toxina en los medios de cultivo por las cepas más toxigénicas son expresadas en DMM, que significa, dosis mínima mortal en ratón.

Efecto biológico de las neurotoxinas botulínicas

Las neurotoxinas tienen un efecto paralizante periférico debido a que producen un bloqueo de la liberación de acetilcolina a nivel presináptico de las uniones mio-neurales colinérgicas. Su efecto es mucho menor en las fibras de transmisión adrenérgicas.
Las investigaciones sobre el mecanismo de acción de las toxinas demuestran que éstas no bloquean la transmisión nerviosa o la respuesta del músculo a antagonistas. No inhiben ni la síntesis de aceticolina ni su degradación.
Las toxinas actúan en tres etapas sucesivas:

Fijación de las toxinas por medio del fragmento H a los receptores de membrana pre-sinápticos. Estos receptores podrían ser de dos tipos ,( gangliosidos y proteínas). Es una etapa que no requiere ni energía ni iones Ca++. Especialmente reversible administrando un suero antibotulínico específico.
Translocación o internalización de la toxina en las vesículas de la neurona pre-sináptica. Es una etapa que no requiere energía y que no es reversible. No se sabe como este polipéptido de peso molecular elevado se introduce, pero parece estar implicado un proceso de reorganización de la membrana nerviosa, ( por ejemplo por endocitósis).
Etapa lítica que se traduce por parálisis. Afecta a la estructura membranal del citoplasma alrededor del espacio presináptico. El bloqueo de la exocitosis, (liberación), de la AcCh se produce por un mecanismo molecular desconocido, podría tratarse de una reacción enzimática, cuya principal consecuencia es el bloqueo de la secreción de AcCh, y por tanto de la excitación del músculo.

Sintomatología

Los síntomas observados en el botulismo se explican bastante bien, teniendo en cuenta la acción de estas toxinas sobre las fibras nerviosas colinérgicas, cuyo neuromediador es la acetilcolina. Pertenecen a este tipo las fibras colinérgicas de la musculatura lisa, las de las terminaciones nerviosas parasimpáticas posganglionares, y algunas terminaciones nerviosas simpáticas posganglionares.
La enfermedad aparece de 2 a 24 horas después de la intoxicación y se caracteriza por:
Parálisis oculares: problemas de acomodación, midriasis, visión doble. Más raramente aparece estravismo y oftalmoplegia.
Sequedad de la boca: por defecto de la salivación.
Problemas de deglución y en el habla.
Constipación y a menudo retención de orina.
Ausencia de trastornos sensitivos,

Las parálisis oculares se presenta únicamente en formas leves y suelen ser los síntomas que primero aparecen y los últimos que desaparecen.
En las formas graves se observan parálisis de los músculos respiratorios, por ejemplo diafragma, músculos intercostales. Raramente parálisis de la musculatura estriada voluntaria, como nervios adrenérgicos. Casi nunca se producen vómitos. En las formas gravísimas se pueden producir pérdida de conciencia.

Epidemiología

El Clostridium Botulinum se encuentra en los suelos, en los sedimentos marinos y a partir de estos lugares puede contaminar los alimentos. Investigaciones de tipo ecológico sobre el reparto de los diferentes tipos toxigénicos han demostrado que existe una distribución desigual en los diferentes continentes que influye, como es lógico, en la epidemiología humana.
En lo que respecta al hombre, la historia del botulismo y su epidemiología, están ligados esencialmente a los hábitos alimentarios y a la tecnología de los alimentos. La observancia de las buenas prácticas de fabricación y profesionales en la industria conservera ha hecho que sean rarísimos los casos de botulismo debido al consumo de conservas industriales y, si hay alguno, siempre se debe a un error de fabricación.
Más frecuentes son los casos de botulismo debidos al consumo de conservas caseras, insuficientemente esterilizadas, ( carnes, sobretodo de cerdo, hortalizas: espárragos, habas verdes, guisantes, champiñones, etc), o de otros productos conservados por otros procedimientos: salazones, productos conservados en grasa, productos ahumados.
La conservación de los alimentos en envases  plásticos, ha sido el origen de algunos casos de botulismo, ya que en estos envases las condiciones son anaeróbicas, debido a un vacío parcial. La utilización actualmente de atmósferas de CO2 que acidifican el alimento ha convertido este tipo de accidentes en rarísimos. No se ha señalado nunca ningún brote de botulismo, por el consumo de alimentos congelados.

Prevención

Radica  con respecto a una tecnología alimentaria correcta:

En todos los casos:
Limpieza cuidadosa de los alimentos que se utilizan como materia prima en las conservas, lavado y pelado.
Utilización de productos frescos.
A nivel familiar:
Esterilización de las conservas en recipientes tipo autoclave.
Conservación en lugares frescos de estos productos, en especial las semiconservas
Salazonado correcto.

A nivel industrial:
Respeto a los tratamientos de esterilización, (conservas), y concentraciones en sal.
Controles bacteriológicos del producto.
Vigilancia e higiene en la distribución.